Цепная реакция. как работают тесты на коронавирус?

Разновидности ПЦР-анализов

Вариаций такой ПЦР диагностики существует много. Выбор определенного метода зависит от многих факторов: предположительного диагноза, возможностей доступных лабораторий, метода взятия материала и пр.

Наиболее часто используются такие разновидности ПЦР:

• вложенная;
• ступенчатая;
• с горячим стартом;
• виртуальная;
• ассиметричная;
• в реальном времени и т. д.

Преимущественно используют ПЦР в реальном времени, так как способ характеризуется самыми точными результатами и максимальной скоростью обработки данных. После его применения заключение готово через час-два.

Если врач выдает направление на обследование с применением полимеразной цепной реакции, то он должен уточнить, какой именно биоматериал необходимо предоставить пациенту и каким образом подготовиться к отбору пробы.

Анализ крови

Кровь в качестве биоматериала для тестирования берут при подозрении на ВИЧ, вирусный гепатит, токсоплазмы, половой герпес и цитомегалию. Для большинства этих патогенов до использования этого метода диагностика базировалась на выявлении антител к возбудителю, что сильно затягивало время обнаружения микробов в тот период, когда антитела еще не вырабатываются.

Перед сдачей крови для диагностики в данном случае не нужны особые приготовления, но лучше, если проба будет отобрана натощак. Единственное обстоятельство, способное серьезно исказить результаты — прием антибиотиков, поэтому сдаче должен предшествовать временной отрезок после приема подобных лекарств в несколько дней или недель в зависимости от типа антибиотика.

В самых современных клиниках в последнее время для отбора крови на ПЦР используют вакуумные системы, которые минимально повреждают кожные покровы и сводят к минимуму вероятность попадания в пробу загрязняющих агентов из воздуха, инструментов или рук лаборантов.

Анализ мазка

Используется как в гинекологии, так и в венерологии для определения заболеваний, передающихся половым путем. Часто назначают ПЦР мазка во время беременности для выявления скрытых факторов, способных негативно повлиять на формирование плода или ход беременности.

Подготовка к отбору материала заключается в том, чтобы полностью исключить половые контакты за несколько суток до процедуры. Проводить спринцевания марганцовкой или настоями трав тоже нельзя. На протяжении критических дней и 2-х дней после них мазок на ПЦР-анализ не берется.

Отбор биоматериала производят в лаборатории из влагалища, шейки матки, цервикального канала или уретры.

ПЦР-анализ мазка позволяет выявить патоген, который устойчив к определенному виду антибиотиков. Кроме того, показаниями к такому виду диагностического обследования выступают:

• осложненная беременность без видимых причин;
• острое течение венерической болезни;
• предположительное хроническое течение венерического заболевания;
• выявление причин бесплодия или самопроизвольных абортов.

Анализ кала

Анализ кала с применением полимеразной цепной реакции назначается специалистом для уточнения наличия инфекции. Подготовка к отбору пробы кала для ПЦР заключается в следующем:

• исключить за несколько суток слабительные средства в виде любых свечей, масел или оральных медикаментов;
• не употреблять накануне лекарства или продукты, которые придают калу выраженную окраску.

Материал для ПЦР-определения лучше всего доставить в специальном контейнере для кала с палочкой. Внутреннее пространство контейнера стерильно, поэтому протирать или промывать его не следует

Во время отбора образца важно отслеживать, чтобы не задеть внутреннюю поверхность приемника, также в пробе не должно быть следов мочи. Перед отбором запрещено применение клизм

Анализ мочи

Такое исследование с помощью ПЦР позволяет извлечь ДНК образец вируса или бактерии. Забор мочи лучше проводить утром натощак. Лучше всего, если это будет происходить непосредственно в лаборатории.

Обязательные условия подготовки для получения результатов исследования мочи в лаборатории полимеразной цепной реакции:

• выдержать 3 недели после приема антибиотиков;
• перед отбором жидкости не пить и не есть;
• запрет вагинального секса за сутки до сдачи пробы;
• в контейнер нужно поместить первую порцию материала после пробуждения.

НЕ СОБЛЮДЕНЫ ПОСТУЛАТЫ КОХА

Кроме того, нет научных доказательств того, что эти последовательности РНК являются возбудителем того, что называется COVID-19.

Чтобы установить причинную связь, так или иначе, то есть помимо выделения и очистки вируса, было бы абсолютно необходимо провести эксперимент, который удовлетворял бы четырем постулатам Коха. 

1. Микроорганизм/вирус постоянно встречается в организме больных людей (или животных) и отсутствует у здоровых.
2. Микроорганизм/вирус должен быть изолирован от больного человека (или животного) и его штамм должен быть выращен в чистой культуре.Чтобы только выделить его каждый раз нужны огромные средства.
3. При заражении чистой культурой микроорганизма/вируса здоровый человек (или животное) заболевает. Кто это делал: заражал людей, да никто, это невозможно. А животные не дадут четкой картины.
4. Микроорганизм/вирус должен быть повторно изолирован от экспериментально заражённого человека (или животного).

Но такого эксперимента нет и не было, как недавно рассказали Эмори Деверо и Розмари Фрей.

Одним из примеров является исследование, опубликованное в журнале Nature 7 мая . Это испытание, помимо других процедур, делающих исследование недействительным, не соответствовало ни одному из постулатов.

Например, у предполагаемых «инфицированных» лабораторных мышей не было выявлено каких-либо значимых клинических симптомов, явно связанных с пневмонией, которая, согласно третьему постулату, должна действительно возникнуть, если там действительно бы действовал опасный и потенциально смертельный вирус. А легкая взерошенность и потеря веса, которые временно наблюдались у животных, незначительны не только потому, что они могли быть вызваны самой процедурой укола неизвестным организму веществом, но также итот факт. что вес снова вернулся к норме.

Показательно, что ни один из ведущих немецких представителей официальной теории SARS-Cov-2 / COVID-19: — Институт Роберта Коха (RKI), Александр С. Кекуле (Университет Галле), Хартмут Хенгель и Ральф Бартеншлагер (Немецкое общество) по вирусологии), вышеупомянутые Томас Лёшер, Ульрих Дирнагл (Шарите Берлин) или Георг Борнкамм (вирусолог и почетный профессор Гельмгольц-центра Мюнхена) — могли бы ответить на следующий вопрос, который им отправили:

Если частицы, которые, как утверждается, принадлежат к SARS-CoV-2, не были очищены, как вы хотите быть в этом уверены, что последовательности генов РНК этих частиц принадлежат конкретному новому вирусу?

В частности, если есть исследования, показывающие, что вещества, такие как антибиотики, которые добавляются в пробирки в экспериментах in vitro, проводимых для обнаружения вирусов, могут «подвергать стрессу» культуру клеток таким образом, что образуются новые последовательности генов, которые ранее не были обнаружены — как аспект, на который лауреат Нобелевской премии Барбара МакКлинток уже обращала внимание в своей Нобелевской лекции еще в 1983 году . Но мы не получили ответов до 18 июня 2020 года, после нескольких месяцев отсутствия ответа. В конце концов, мы добились этого только с помощью берлинского юриста Вивиан Фишер

Но мы не получили ответов до 18 июня 2020 года, после нескольких месяцев отсутствия ответа. В конце концов, мы добились этого только с помощью берлинского юриста Вивиан Фишер.

Шарите признает, что они не использовали очищенные частицы.

Вирусологи из клиники Шарите заявляют:

Это означает, что они просто предположили, что РНК была вирусной .

Между прочим, Corman et al. Документ, опубликованный 23 января 2020 года, даже не прошел надлежащего процесса рецензирования, и описанные в нем процедуры не сопровождались контролем — хотя только благодаря этим двум вещам научная работа становится действительно научной.

Зонд или SYBR® Green. Выбор правильной системы визуализации для вашего эксперимента.

SYBR Green (или любой другой интеркалирующий краситель)

SYBR Green является наиболее используемым интеркалирующим красителем в современной практике. Кроме него существует множество других красителей подобного класса, но наверняка вы слышали именно о SYBR Green. Принцип действия у них один: сам краситель имеет собственный флуоресцентный фон, но связываясь с двухцепочечной ДНК, он встраивается между ее цепочками. Это приводит к изменению конфигурации молекулы красителя, заставляя ее  флуоресцировать горазда сильнее. Все просто – чем больше ДНК образуется в процессе ПЦР, тем сильнее происходит флуоресценция в образце.

Метод петлевой изотермической амплификации, LAMP

Метод петлевой изотермической амплификации, LAMP (от англ.Loop-mediated isothermal amplification) считается упрощенной ПЦР. Производители тест-систем обещают точность метода до 94%.

Во многом метод LAMP схож с ПЦР, за исключением ряда нюансов: праймеров требуется больше, амплификаторов (приборов, периодически изменяющих температуру) не требуется вовсе, как не требуется и электрофореза. РНК вируса также достраивается до ДНК, а дальше копирование идет при постоянной температуре и занимает всего 20-30 минут.

Чтобы увидеть результат, не требуется электрофорез, достаточно просто взглянуть на пробирку. Мутный осадок говорит о том, что в образце обнаружен вирус. Осадок частично состоит из ионов, освобождающихся из «букв»-нуклеотидов во время синтеза ДНК. Если он появляется, значит, ДНК вируса удалось размножить. Многие производители добавляют в свои тест-системы флуоресцентные красители ДНК, чтобы наличие или отсутствие вирусной частицы не вызывало сомнений.

Reuters

Время имеет значение

Также не стоит забывать и о времени, которое в вопросе определения наличия вируса в организме играет решающую роль. «Очень многое зависит от того, на каком сроке болезни находится пациент. Если это день, когда вирус размножается, то человек должен получить положительный тест. Но если точно такой же тест пациент делает на 15–20-й день после первых симптомов, то у человека может быть и отрицательный результат. Хотя пациент болен, налицо уже все последствия, пневмония, но самого вируса уже нет. Та же пневмония, которая может активно развиваться, уже не зависит от наличия вируса в организме», — говорит «Вестям» Гриневич.

По его словам, на более поздних сроках болезни, например с пятого по одиннадцатый день, Covid можно будет обнаружить с помощью компьютерной томографии. То же самое касается и экспресс-тестов.

«По ИФА-диагностике особенность следующая: антитела начинают образовываться только с седьмого дня. И в дальнейшем их становится все больше. Сначала появляются антитела М, потом — где-то с третей недели — появляются антитела G. И если человек переболел, то у него есть антитела G. Но в последнее время появляется множество информации о том, что человек переболел, а антител у него нет. Человек может заболеть повторно, и, как правило, повторные заболевания гораздо более тяжелые, чем легкое первичное», — говорит «Вестям» Гриневич.

Подготовка к сдаче материала

Для получения корректного результата необходимо придерживаться определённых правил. Тест делают в момент обострения болезни. За 3 суток до исследования необходимо приостановить прием лекарств, особенно антибиотиков. Повторить анализ нужно через месяц после выздоровления. Забор делают при помощи стерильных одноразовых инструментов.

Подготовка к ПЦР-должна быть следующей.

По поводу какой болезни проводится исследование	Пол пациента	Меры по подготовке
Гепатиты (берётся кровь)	Мужчины, женщины	прийти натощак; избегать излишних физических нагрузок; не курить за час до сдачи крови; за два дня не пить алкоголь и не употреблять жирное
Инфекции мочевыводящих и половых органов	Женщины	не использовать вагинальные препараты; за 5 дней до ПЦР не делать кольпоскопию и трансвагинальное УЗИ; не сдавать анализ во время месячных; воздержаться от интимной жизни за 3 дня до обследования; подмываться простой водой без применения моющих средств; не делать спринцевания; не мочиться за 2 часа до ПЦР
Мужчины	за 3 дня воздержаться от интимных отношений; мыть половые органы простой водой без мыла; не ходить в туалет «по-маленькому» за 3 часа до сдачи анализа
ЛОР инфекции (мазок носо- и ротоглотки)	Мужчины, Женщины	не применять лекарства для носа и полости рта; не курить за час; за 2-3 часа не есть; не чистить зубы

Метод ПЦР

ПЦР — это метод полимеразной цепной реакции. О нем наслышаны многие, хотя до эпидемии значение аббревиатуры ПЦР было знакомо лишь криминалистам, генетикам, а также лабораторным работникам, определяющим ВИЧ, сифилис, гепатиты, туберкулез и еще ряд заболеваний.

Как работает ПЦР и какие бывают вирусы

ДНК — это двойная спираль, кодирующая генетическую информацию, в том числе, вирусов. Обе части ДНК соединены по принципу комплементарности. То есть, один элемент может соединяться только с соответствующим ему. Например, гуанин (G) только с цитозином(C). ДНК-содержащие вирусы — это вирус герпеса, оспы, гепатита В. Коронавирус относится к РНК-содержащим вирусам.

Для исследования методом ПЦР берется мазок из ротоглотки. Если в материал для анализа попала вирусная частица, то в лаборатории одна нить ее РНК достраивается до двойной спирали ДНК.

РИА Новости/Сергей Пивоваров

В чем суть метода ПЦР?

Вместо того, чтобы искать иголку в стоге сена (одну нить вирусной частицы), можно сделать целый «клубок» нитей, найти которые не составит труда. Нуклеотидная последовательность («буквы») РНК вируса уже расшифрована. И к этим «буквам» по принципу комплиментарности присоединяются в результате химической реакции другие. В итоге получается молекула ДНК. Она служит матрицей. Затем ее многократно размножают примерно по той же технологии. ДНК помещают в раствор со специальным набором химических веществ в устройство-амплификатор, в котором периодически меняется температура от 50 до 92 градусов. В нем, как в ксероксе, ДНК копируется.

Финальный этап исследования – электрофорез, на нем можно увидеть размноженные копии ДНК. ДНК заряжена отрицательно, и в электрическом поле ее притягивает положительный заряд. Притягиваясь к нему, размноженная ДНК проходит через краситель. Чем больше фрагмент ДНК, тем медленнее он двигается и тем ярче окрашивается.

Если в биоматериале пациента не было вирусной частицы, то и первая цепочка ДНК не выстроится – химическим веществам, подобранным для строительства, не за что будет «зацепиться». Соответственно, форез ничего не покажет.

Анализ методом ПЦР

ПЦР анализ — что это такое? Это метод использует принципы молекулярной биологии. Для исследования материала применяются особые ферменты, которые многократно и быстро копируют ДНК, РНК фрагменты возбудителей болезни. Существует разные виды ПЦР анализа в зависимости от исследуемого материала (кровь, моча, кал и т.д.). После обработки сотрудники лаборатории сравнивают с базой данных полученный результат, выявляют концентрацию, тип возбудителя.

Анализ на ПЦР помещают в специальный амплификатор (прибор), который нагревает и охлаждает пробирки с биоматериалом. Изменения температуры нужны для репликации фрагментов. Точность результата будет зависеть от точности температурного режима. Метод полимеразной цепной реакции помогает выявить:

• инфекционный мононуклеоз;
• ВИЧ;
• цитомегаловирусную инфекцию;
• вирусные гепатиты G, C, B, A;
• инфекции/заболевания, передающиеся половым путем (ИППП/ЗППП): гарднереллез, трихомониаз, уреаплазмоз;
• герпетическую инфекцию;
• онкогенные вирусы;
• листериоз;
• хеликобактерную инфекцию;
• клещевой энцефалит, боррелиоз;
• туберкулез;
• кандидоз.

Крови

На данный момент из-за новизны технологии анализ крови методом ПЦР все еще имеет высокую цену. Для подготовки биоматериала не нужно соблюдать определенные требования. Даже вызванные физическими нагрузками, стрессами, сменой рациона питания изменения состава не влияют на результат исследования. ПЦР анализ крови может испортить только прием антибактериальных средств, поэтому перед сдачей необходимо выдержать паузу между лечением и тестом.

ПЦР исследование крови – самый распространенный вариант диагностики хронических, острых инфекционных патологий при вирусном или атипичном проявлении. Серологические методы исследования имеют определенную трудность при проведении – определение наличия возбудителя проводится по наличию антител в организме человека. Результат мог быть ложноотрицательным, если состояние больного не давало время для их выработки.

Мазка

В сфере гинекологии для исследования наличия инфекционных микроорганизмов используют ПЦР анализ мазка. Работа с материалом проводится по тому же принципу, что и с кровью: многократное увеличение фрагментов ДНК возбудителя, чтобы с легкостью его идентифицировать. Это же помогает обнаружить скрытые инфекции у женщины. Для проведения анализа могут быть взяты разные биологические жидкости: слюна, мокрота, моча, кровь. В гинекологии для точности определения чаще используется мазок со слизистой влагалища из цервикального канала.

Для проведения ПЦР существуют определенные показания. Нередко его нужно сделать, чтобы выявить устойчивый к антибиотикам вид возбудителя. У женщин основными показаниями для диагностики по этому методу выступают:

• беременность, которая протекает тяжело;
• острая фаза ИППП;
• если есть подозрение на переход ИППП в хроническую стадию;
• поиск причин бесплодия.

Кала­

Для выявления инфекции может быть назначен со стороны врача анализ кала на ПЦР. Для того, чтобы получить максимально достоверные результаты после теста, необходимо придерживаться следующих правил перед забором биоматериала:

• за несколько суток прекратить прием слабительных препаратов: масла, свечи;
• исключить медикаменты, которые дают специфическую окраску калу, к примеру, с содержанием железа.

Для забора следует использовать стерильную палочку и контейнер. Чем-либо их дополнительно протирать, ополаскивать не нужно. При сборе материала будьте осторожны, вы не должны задеть рукой внутренние стенки контейнера. Следите, чтобы в кале не было примесей мочи, нельзя использовать дополнительные вспомогательные средства для испражнения (клизма). Собирать материал нужно в день сдачи, хватит 1/3 объема контейнера. Данный метод диагностики имеет следующие преимущества:

1. Анализ способен указывать на ДНК паразита, другие же тесты могут определять только остатки их жизнедеятельности.
2. Высокая точность, будет установлен возбудитель.
3. Ультрачувствительный анализ, который способен выявить даже одну клетку вируса.
4. Результат исследования ПЦР будет готов через 4-5 часов.

Мочи

При необходимости для проведения теста врач может взять для исследования мочу. Высокая точность открывает возможность работать с любой биологической жидкостью, из которой удается извлечь ДНК вируса. Чтобы сдать анализ мочи ПЦР, нужно придерживаться таких ограничений перед забором материала:

• минимум за 1 день до процедуры прекратить половые контакты;
• за 3 недели до сдачи должно быть окончено любое антибактериальное лечение, потому что медикаменты смажут картину;
• сдавать анализ нужно натощак (жидкость тоже запрещена);
• брать нужно первую утреннюю порцию материала.

Особенности ПЦР диагностики

Проявляемая анализом высокая чувствительность к половым инфекциям позволяет работать методикой при разных видах возбудителей.

Лучше всего выявляются уреаплазмы, микоплазмы, хламидии, а также вирусы папилломы, герпеса, гепатитов, ВИЧ, цитомегаловирус.

Есть возможность применить диагностическую тактику сразу после заражения.

В ходе исследования амплификатор периодически нагревает и охлаждает образцы с добавленными ферментами-ускорителями в пробирках.

На первом этапе расщепляют двойную цепочку ДНК искомого возбудителя.

Затем на ее короткий участок садятся два праймера (затравки) из стандартного набора, уникальные для данного возбудителя.

Для образования гибрида между матричной ДНК и праймером требуется повысить температуру.

После этого происходит удвоение участков ДНК инфекционного агента и их выделение электрофорезом и выявление.

В дальнейшем участок можно изучать и типировать.

Методика незаменима в ситуациях, когда возбудители не поддаются культуральному выращиванию, ускользают от серодиагностики.

Цена мазка и крови может несколько отличаться в разных клиниках и лабораториях.

Целесообразно, чтобы забор материала проводился в клинике, оснащенной лабораторными мощностями.

Это позволяет ограничить загрязнение образцов посторонними микробными примесями.

Что такое ПЦР на ИППП

ПЦР (полимеразная цепная реакция) на ИППП – это анализ, который позволяет выявить 12 самых распространённых инфекционных заболеваний, передающихся половым путем.

Показания к назначению ПЦР на ЗППП

Показания к назначению ПЦР на ИППП:

• высыпания в области половых органов;
• боль во время мочеиспускания;
• зуд или жжение;
• обильные выделения с резким и неприятным запахом;
• эрозии на слизистой или в области гениталий;
• видоизменение (разрастание эпителия) слизистой в области шейки матки;
• воспаление мочеполовой системы;
• изменение цвета семенной жидкости у мужчин;
• увеличение лимфатических узлов в области паха;
• нарушение менструального цикла;
• случаи выкидышей, патологий при беременности, трудности с зачатием;
• наличие кисты на яичниках;
• наличие спаек в области малого таза;
• боли внизу живота;
• наличие простатита у мужчин.

Следует отметить, что вне зависимости от симптомов, проходить обследование должны все в случаях:

• незащищенного полового акта с двумя или более партнёрами в течение 6 месяцев;
• планирование беременности.

Преимущества и недостатки метода

Преимущества метода:

1. Высокий процент достоверности. Даже если в биоматериале была обнаружена единичная клетка возбудителя, диагностика её выявит.
2. Оперативность получения результата.
3. Универсальность исследования. ПЦР на ИППП можно выполнять при взятии любого материала: мазок из влагалища или уретры, кровь, сперма.
4. Специфичность процедуры. Во время анализа находят специфичный фрагмент ДНК, который принадлежит конкретному вирусу.
5. Доступность. Проводят такие обследования практически все лаборатории.
6. Достаточно одной пробы, чтобы определить наличие или отсутствие ИППП.

Есть и недостатки в проведении процедуры, которые необходимо учитывать, прежде чем сдавать анализ:

1. Вероятность ложного результата. Её процент очень низкий, но все же возможен.
2. Возможность микроорганизмов мутировать структуру ДНК. В таком случае выявить болезнь будет сложно. Это редкость, но стоит учитывать этот фактор при обследовании.
3. Некоторых возбудителей сложно выявлять. Например, хламидиоз или трихомоноз. Чтобы результат был точным, приходится прибегать к стимуляции. Такие инфекции называют скрытыми.

Какие заболевания можно выявить с помощью ПЦР?

С помощью ПЦР методики можно обнаружить практически все вирусы и инфекции. Комплексный анализ предполагает сдачу стандартного перечня именуемого в медицине группа «ИППП-12».

Состав комплекса ИППП-12

ИППП-12 может применяться при целом комплексе инфекций, в который входят:

1. Уреаплазмоз. Обычно протекает бессимптомно, но может стать причиной выкидыша, поэтому требует незамедлительного лечения при планировании беременности.
2. Микоплазмоз. Наиболее распространённые симптомы: боли в паху (усиливаются при половом акте), жжение при мочеиспускании, выделения. Мужчины являются носителями.
3. Хламидиоз. Хламидии опасны тем, что поражают уретру, кишечник и шейку матки. При отсутствии надлежащей терапии приводят к бесплодию у женщин.
4. Трихомонада. К наиболее частым симптомам относятся: покраснение и отёк половых органов, обильные выделения с резким неприятным запахом, небольшие язвочки на гениталиях. У мужчин заражение всего проходит бессимптомно, но может появляться жжение при мочеиспускании. Наряду с этой инфекцией, врачи могут выявить у женщин ещё такое заболевание, как трихомонадный кольпит. При отсутствии надлежащего лечения поражаются матка, яичники и мочевой пузырь.
5. Кандидоз (молочница). Самые распространённые симптомы: зуд и обильные творожистые выделения.
6. ВПЧ (вирус папилломы человека) 16 и ВПЧ 18. Различают бессимптомные (дисплазия) и клинически ярко выраженные варианты заболевания (кондиломы, папилломы и бородавки). Большинство из них безопасные. Но необходимо постоянно наблюдаться у гинеколога. Самым опасным осложнением является онкология.
7. Цитомегаловирус. Чаще всего протекает бессимптомно. Но может проявляться в виде обычной ОРВИ.
8. Генитальный герпес тип 1 и тип 2. На половых губах появляется небольшое красноватое пятнышко, которое вызывает чувство жжения и зуда. Затем надувается пузырёк и нарастают болевые ощущения. Через 3–5 дней волдырь лопается и вытекает жидкость. На месте ранки образуются корочки. На десятый день все симптомы полностью исчезают.
9. Гонорея. Возбудителем которой является нейссерия. Симптомы: сильные боли внизу живота, жжение и дискомфорт при мочеиспускании, выделения желтовато-белого цвета с резким неприятным запахом.
10. Гарднереллёз (бактериальный вагиноз). Симптоматика схожа с молочницей.
11. Сифилис и нейросифилис (по симптоматике похож на менингит).
12. ВИЧ (СПИД).

Новое открытие

В 70-х годах двадцатого века были открыты ферменты, расщепляющие ДНК в специфических точках. Исследователи получили возможность «разрезать» ДНК на более короткие и стабильные фрагменты.

После этого последовало новое открытие: ученые «научили» ДНК копировать саму себя и достраивать до таких размеров, которые легко опознать. Фактически это позволило идентифицировать по выделенному фрагменту ДНК любой интересующий объект:

• вот — ДНК возбудителя насморка,
• это — стафилококка,
• это — вируса герпеса.

В качестве материала для анализа можно использовать:

• пробу ткани пациента,
• одиночный человеческий волос,
• каплю засохшей крови (обнаруженную на месте преступления),
• мозг мумии.

Даже тело мамонта, пролежавшего 40 тыл. лет в вечной мерзлоте, сможет рассказать, чем болел доисторический гигант.

Все больше и больше специалистов рекомендуют ПЦР-диагностику вместо обычных бактериологических анализов. В первую очередь это урологи и гинекологи — в их сфере плюсы метода ценятся особенно высоко.

Быстро и с гарантией выявляются все зловредные возбудители урогенитальных инфекций:

• хламидиоза,
• уреаплазмоза,
• гонореи,
• герпеса,
• гарднереллеза,
• микоплазменной инфекции и др.

Взяли на вооружение новый метод и пульмонологи (врачи, которые занимаются заболеваниями легких), ведь он позволяет различать вирусные и бактериальные пневмонии, туберкулез. В гематологии ДНК-диагностика выявляет цитомегаловирусы, онковирусы. Ну и, конечно же, не остались в стороне врачи-инфекционисты:

ПЦР используется в качестве экспресс-метода диагностики:

• сальмонеллеза,
• дифтерии,
• вирусных гепатитов В, С и G.

ПЦР-диагностика: много плюсов и один большой минус

Преимущества метода:

— Возбудитель выявляется непосредственно, по специфическому участку ДНК, в отличие от иммуноферментного анализа, при котором вредный микроб выявляется косвенно (по особым белкам — продуктам его жизнедеятельности).

— Возможна четкая идентификация ДНК одного определенного возбудителя. Метод позволяет не спутать его ни с каким другим, как это бывает в том же иммуноферментном анализе, где антигены нескольких микроорганизмов нередко реагируют перекрестно.

— Метод может выявить даже одну-единственную болезнетворную бактерию среди миллиардов других и через несколько часов предоставить 50 миллиардов ее копий! То есть он работает там, где другие методы (микроскопический, бактериологический, иммуноферментный) пасуют.

— Метод универсален. Ведь все на свете ДНК состоят из тех же четырех нуклеотидов:

• аденина (А),
• гуанина (Г),
• цитозина (Ц),
• тимина (Т).

Поэтому способ применим абсолютно для любых бактерий и вирусов. Причем обнаружить можно не только кого угодно, но и где угодно в:

• крови,
• моче,
• мокроте,
• биоптате (маленький кусочек ткани),
• почве.

Результаты анализа можно получить чрезвычайно быстро, ведь возбудителя не надо выращивать искусственно (именно эта процедура при лабораторном исследовании занимает много времени). Ответ, как правило, готов уже через 3-4 часа после обращения.

Один недостаток — сверхчувствительность

Как это часто бывает, достоинства метода иногда становятся и его недостатками. Речь идет о феноменальной чувствительности ПЦР, которая может оборачиваться «ложноположительными» результатами, если в посуде, пипетках и прочем оборудовании для анализа будет хотя бы крошечное количество «чужеродной» ДНК. ПЦР размножит эту ДНК и выдаст неправильный результат.

Но эта проблема решаема — посуда и материалы должны быть одноразовыми, а амплификацию (многократное копирование) ДНК необходимо проводить в отдельном от подготовки проб помещении. Именно поэтому доверять результатам ПЦР-диагностики можно, если вы обратились в солидную лабораторию, оснащенную по последнему слову техники.

Встройте «Правду.Ру» в свой информационный поток, если хотите получать оперативные комментарии и новости:

Подпишитесь на наш канал в или в

Добавьте «Правду.Ру» в свои источники в Яндекс.Новости или News.Google

Также будем рады вам в наших сообществах во , Фейсбуке, Твиттере, Одноклассниках…

Что нужно учитывать: специфичность

Зонды: В общем случае, линейно разрушаемые зонды дают более точные результаты. Объясняется это их высокой специфичностью. Если вы получаете флуоресцентный сигнал от зонда, то можно быть уверенным, что он гибридизировался именно с целевым участком генома – гибридизация происходит исключительно в ограниченом праймерами пространстве. Благодаря этому нет необходимости проводить постамплификационных анализов для того, чтобы убедиться, что все прошло правильно.

Интеркалирующие красители: Слабым местом интеркалирующих красителей является то, что они неспецифичны. Если во время ПЦР поисходит амплификация не того участка ДНК, либо вовсе нескольких разных участков, вы все равно получаете кривую амплификации, которая идентична кривой при амплификации целевых генов. Интеркалирующие красители генерируют флуоресцентный сигнал при связывании с любой двухцепочечной ДНК, независимо от ее нуклеотидной последовательности. То есть, необходимо проводить дополнительные анализы, которые подтверждают наличие специфичных продуктов амплификации, например, оценку графика температуры плавления ампликонов. Подобные виды анализов требуют высокого уровня квалификации оператора, но только благодаря им можно рассчитывать на достоверность полученных данных.

Достоинства и недостатки метода

Мнения врачей-инфекционистов однозначны: в 4/5 случаев точность проведенного исследования позволяет определить, что человек болен именно коронавирусной инфекцией, и можно начинать лечение. Особенно это ценно при бессимптомном протекании болезни, когда ее невозможно выявить на основании очевидных признаков.

Для исключения погрешности рекомендовано неоднократное тестирование. Об этом говорится в рекомендациях ВОЗ, но медики уже давно самостоятельно пришли к такому выводу, анализируя процент ложноотрицательных диагнозов.

От того, как быстро проводится ПЦР-тест на коронавирус, зависит использование преимуществ: можно начинать терапию на раннем этапе заражения, не дожидаясь, пока настанут осложнения. Пока другие методы не могут определить достоверно присутствие SARS-CoV-2, ПЦР уже определяет наличие вирионов. Можно назначать лечение, препятствовать распространению инфекции, отправляя пациента на больничный или на самоизоляцию.

То, что показывает ПЦР, нельзя определить другими методами: анализ исключает возможность самоизлечения (а она не может определяться при серологическом исследовании). Это дает объяснение повышенным показателям в общем анализе крови, может определить, чем именно они вызваны, помогает осуществлять контроль за лечением.

Определение наличия конкретного вируса – важная составляющая лечения и несомненная прерогатива проведения анализа. Достоинства метода не только в этом. Можно диагностировать инфекцию даже при ничтожном содержании в биоматериале, в инкубационном и латентном периоде. 

К недостаткам относят:

• невозможность применить методику в качестве единственного диагностического теста;
• невозможность выяснить стадию заболевания;
• невозможность определить давность контакта с источником патогена;
• невозможность выяснить инфекционную нагрузку;
• немалую цену за проведение тестирования.

Для этого используются другие прогрессивные диагностические методы: тест на иммуноглобулины (спустя месяц после старта деятельности вируса), эластометрию (для определения изменений в клетках с помощью фиброскана). Все они целесообразны после подтверждения присутствия коронавирусной инфекции в организме.